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人类长链非编码RNA芯片检测

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),是一类可转录但不具有蛋白编码功能的RNA成分,包括我们熟知的参与蛋白翻译过程的tRNA,rRNA,参与RNA剪接的snoRNA,具有调控功能的短片段miRNA、piRNA,以及众多长片段非编码RNA等。
博奥生物根据非编码RNA领域不断取得的研究进展,推出并更新了晶芯lncRNA检测芯片,该芯片不但包括众多lncRNA数据库最新版本,更具特色的是还包括了中科院生物物理所陈润生院士研究组发现的约848条中等长度的非编码RNA。这是目前涵盖lncRNA序列最全面的一款产品。
为了便于研究者使用,晶芯lncRNA芯片V3同时针对lncRNA和mRNA进行检测,包括约3.7万条lncRNA和约3.4万条mRNA检测的探针,这样,一张芯片检测就能同时发现差异表达的lncRNA和mRNA,并挖掘二者之间的关联。在充分保证探针容量和重复数量(lncRNA和mRNA检测探针均重复2次或以上)的前提下,降低了芯片成本和实验费用。
通过lncRNA芯片检测,研究人员能够快速高通量的获得与特定生物学过程或者疾病相关的lncRNA的表达变化,从而极大促进lncRNA的深入研究。

lncRNA背景介绍| 晶芯 lncRNA芯片V3.0| 检测原理| 产品优势| 芯片序列来源对比| 数据分析|

ncRNA分类

     通常意义上的lncRNA,是指转录本长度超过200个核苷酸的RNA转录本。这是一方便的定义,只是根据剔除小RNA  的实验阈值来对lncRNA进行的约定。lncRNA长度分布可从几百到十几万nt。非编码RNA领域是当前研究热点,取得了很多成果,但大部分研究都集中在microRNA方面。对长非编码RNA(long noncoding  RNA,  lncRNA)的研究相对来说较少,lncRNA仍属于当前研究最不清楚的转录产物之一。
       lncRNA功能多样,主要表现在调控基因表达和表观遗传修饰方面。lncRNA能形成一定的二级结构,结合转录因子等蛋白质,调节蛋白质的活性,从而广泛影响转录调控。lncRNA能招募染色质重构复合体到特定染色质位点介导相关基因的表达沉默,lncRNA也可直接结合到DNA上,如基因promoter区,影响其转录。已了解的lncRNA的主要功能还包括:参与mRNA的稳定和翻译水平的调节、参与蛋白质的运输、参与RNA的加工和修饰等。与蛋白编码基因转录水平相比,lncRNA的表达水平一般都比较低,这可能与lncRNA主要参与调控作用的功能相适应。
       lncRNA与疾病关系也很密切,已报道的研究主要集中在肿瘤、神经退行性疾病等方面。lncRNA可以作为疾病分子标记物。在肿瘤细胞中,一些lncRNA的表达水平会发生显著改变,如前列腺癌中的lncRNA,DD3。这种表达水平的变化能够作为癌症诊断的标志物和潜在的药物靶点。
      长链非编码RNA研究领域的进展离不开基因组测序和基因芯片技术的广泛使用,如通过构建cDNA文库和测序发现ncRNA;通过比较基因组生物信息分析发现ncRNA;利用tiling芯片、ncRNA芯片检测ncRNA。通过转录组测序或tiling芯片检测,可以在全基因组范围内系统地研究可转录RNA区域,有助于大量发现非编码RNA。基因芯片可以高密度检测所有非编码RNA,通过表达谱研究发现组织特异性、疾病相关性,就可以缩小研究范围,找出值得深入研究的ncRNA目标,再结合传统的基因敲除、RNAi等技术确定其功能和作用机制。
      博奥生物根据非编码RNA领域不断取得的研究进展,推出并更新了晶芯lncRNA检测芯片,该芯片不但包括众多lncRNA数据库最新版本,更具特色的是还包括了中科院生物物理所陈润生院士研究组发现的约848条中等长度的非编码RNA。这是目前涵盖lncRNA序列最全面的一款产品。通过lncRNA芯片检测,研究人员能够快速高通量的获得与特定生物学过程或者疾病相关的lncRNA的表达变化,从而极大促进lncRNA的深入研究。

 

博奥生物有限公司与中国科学院生物物理研究所的陈润生院士课题组合作,相继成功推出lncRNA V1.0 和 V2.0 芯片服务 。鉴于当前lncRNA 研究的快速进展,我们收集和更新lncRNA 序列信息,经过严格的序列筛选和整合,推出了新一代的晶芯lncRNA V3.0 芯片服务。芯片序列来源如下:

数据库
数据下载路径
所下载的数据文件名
数据下载时间
1. imsRNA
来自chenlab.ibp.ac(中科院生物物理所陈润生院士实验室)
2011.02.03
2. ENSEMBL
Homo_sapiens.GRCh37.71.gtf.gz
2013.04.24
3. GENCODE
gencode.v16.long_noncoding_RNAs.gtf.gz;gencode.v16.annotation.gtf.gz
2013.04.24
4. RefSeq
ref_GRCh37.p10_top_level.gff3.gz
2013.04.24
5. UCSC
2013.04.24
6. Human LincRNA Catalog
lincRNAs_transcripts.gtf
2013.04.24
7. H-InvDB
h-inv_pub.gff3.gz
2013.04.24
8. NRED(ncRNA Expression Database)
2013.04.24
9. Hox lncRNAs (lncRNA transcribed from HOX loci LncRNAs)
PIIS0092867407006599.mmc3.xls
2011.04.06
10. lncRNAdb
2013.04.24
11. RNAdb
2013.04.24
12. lincRNA from Khalil et al.
SD1.xls
2013.04.24
13. T-UCRs (lncRNA transcribed from ultraconserved regions)
mmc4.xls
2013.04.24
14. LncRNA-a
mmc1.xls
2011.04.06
15. CombinedLit
combinedlitV2.zip
2011.01.09
16. 其他已知类型的ncRNA(tRNA,rRNA,ribozyme,RNase MRP RNA,snRNA,SRP RNA, vault RNA,Y RNA)

lncRNA原理

RNA线性扩增方法具有灵敏度高、重现性好的特点,已经成为用于微阵列芯片分析中样品标记的首选方法。经过博奥lncRNA 检测的优化的扩增方案,将线性扩增产物cRNA 反转录得到DNA,再用Klenow Fragent 酶对DNA进行荧光标记,实现了DNA和芯片上DNA探针的杂交,可以明显地降低杂交的假阳性率。同时,用Klenow Fragent酶标记的DNA片段大小分布在200 bp左右,适合芯片杂交动力学要求。

晶芯lncRNA 芯片检测方法具有极高灵敏度,可以从低至100ng Total RNA 的样品起始完成检测。样品扩增、标记过程图示如下:

lncRNA检测

博奥生物lncRNA芯片检测样品标记过程,主要包括如下步骤:

1. 从Total RNA的样品开始,用含有T7启动子序列的T7 Oligo(dT) Primer和T7 Random Primer为引物,使用CbcScript酶合成1st-strand cDNA。

2. Second strand DNA合成:用RNaseH、DNA Polymerase将DNA-RNA杂合体中的RNA链转化为Second Strand cDNA,合成双链DNA并进行DNA过柱纯化。

3. 体外转录合成cRNA:以双链DNA为模板,利用T7 Enzyme Mix合成cRNA,这一步对RNA进行扩增。

4. cRNA纯化:使用RNA纯化柱纯化cRNA,除去反应中的盐、酶等试剂,并对cRNA进行定量。

5. cRNA反转录:以cRNA为模板,Random Primer为引物,CbcScriptⅡ酶进行反转录。过柱纯化并回收cRNA反转录得到的cDNA。

6. cDNA荧光标记:以反转录的cDNA产物为模板,Random Primer为引物,用Klenow Fragment酶合成cDNA互补链并掺入带有荧光基团的Cy3-dCTP或Cy5-dCTP。纯化并定量标记产物。这些带有荧光基团DNA即可用于芯片杂交。

  • 最新最全面的lncRNA序列序列信息:以 GENCODE/ENSEMBL最新版本的22444条序列信息为基础, 整合了Refseq、UCSC、H-InvDB、Human lincRNA catalog、NRED、lncRNAdb、RNAdb 等13 个主要lncRNA 数据库及相关文献报道的序列,同时也包含陈润生院士组发现的未公开发表的848 条中长度的lncRNA 序列信息,共计73370 条序列信息。
  • 优 化的探针设计:由于lncRNA 与mRNA 在序列上存在很多重叠,在lncRNA 序列选择时就围绕着非编码基因展开,并在陈院士课题组协助下进行基因组定位和序列相似性比对和注释,将收集的7 万多条lncRNA 序列到合并约3.8 万条。针对每条lncRNA 序列设计特异探针,其中部分探针还可以区分不同lncRNA 的可变剪接体。探针信息:约3.8万条lncRNA 探针+ 约3.4 万条mRNA 探针。
  • 高灵敏度及高特异性: 该芯片采用Agilent原位合成方式,设计为60mer的长寡核苷酸探针,兼顾高严谨杂交条件下高灵敏度及高特异性检测效果。
  • 性价比高: 一张芯片检测就能同时发现差异表达的lncRNA和mRNA,并挖掘二者之间的关联。在充分保证探针容量和重复数量(lncRNA和mRNA检测探针均重复2次或以上)的前提下,降低了芯片成本和实验费用。
  • 全面准确的注释:针对V3.0 版本的探针信息进行分类别、详细的注释。

与市场上已有的lncRNA芯片相比,博奥开发的lncRNA芯片是目前商业化芯片中数据库覆盖最完善,版本最新的芯片。另外,最具特色的是芯片所涵盖的中科院生物物理所陈润生院士实验室所发现的848条中长度非编码RNA。博奥生物晶芯 lncRNA同市场上已有ncRNA芯片数据来源对比如下:

数据库CBC lncRNA V2.0CBC lncRNA V3.0ArrayStar V3SBC lncRNA V4Agilent human V2
GENCODE/ENSEMBL1275422444205963675
lincRNAs (Human LincRNA Catalog )81951435314353 8971
NCBI RefSeq4765481439917055
UCSC135215596126942340
NRED1289137011112
H-InvDB172031038
LncRNAs-a(Enhancer-like)297530193019
RNA db 15991492
Antisense ncRNA pipeline10531053
UCRs481962962
CombinedLit529529
Hox ncRNAs407407407
snoRNA389389
lncRNAdb7810410456
lincRNAs by Khalil et al. 25142592
ncRNAs from IBP848848
other database 29720
序列累计636397337061322428468971
去冗余后芯片检测的序列350243749130586410538971