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链特异性全转录组测序服务

链特异性转录组测序(strand-specific RNA)是指在构建测序文库时,利用UDG酶将mRNA链的方向信息保存到测序文库中。测序后的数据分析可确定转录本是来自正义还是反义DNA链。链特异性转录组测序与普通转录组测序相比,能更准确地统计转录本的数量和确定基因的结构,同时可以挖掘lncRNA的信息,发现反义转录本,已经成为研究基因结构和基因表达调控的一个重要的手段。

实验流程| 技术优势| 样品要求| 数据分析|

 

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1. 样品提取总RNA后,过柱纯化,保留 200nt以上的 RNA。
 
2. 去除rRNA,并用二价阳离子高温加热的方法将 去除rRNA后的总RNA片断化。
 
3. 以RNA短片段为模板,用六碱基随机引物反转录合成cDNA的第一条链。
 
4. 合成第二条cDNA链时,将dTTP替换为dUTP。
 
5. 经纯化、末端修复、加碱基 A和测序接头的步骤。
 
6. 利用UDG酶降解cDNA的第二条链后,进行 PCR扩增,完成测序文库的制备。
 
7. 构建好的文库经 cBot扩增,用 Illumina Hiseq2500进行对读测序。

  

链特异性转录组测序除了拥有普通转录组测序优势外,还拥有以下技术优势:
  • 准确性高:因文库制备和测序过程中保留了RNA方向信息,有效数据增多,从而使基因表达定量更加准确。在与基因组和参考基因的比对结果中链特异的结果均相近或稍高于非链特异结果。
  • 精确度高:保留RNA 的方向信息可以使基因注释结果更准确。
  • 获取更丰富的转录信息:发现反义转录本,有助于深层次进行lncRNA研究。
  • 样品类型:细胞、新鲜组织或 RNA样品
  • 样品量:细胞样品请提供至少 1×107个细胞,组织样品请提供至少 100mg的组织块或切片, RNA样品请提供 10 μg以上的总 RNA
  • 样品质量:RNA无明显降解,提取的总 RNAOD260/280值在 1.8~2.2之间,浓度 ≥500 ng/μl,28S:18S≥1.5,RIN≥8
  • 样品保存:细胞样品或新鲜组织块(切成 ~50mg的小块)可用 TRIZOL或RNA保护剂处理或液氮冻存后, -80℃保存。 RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中, -80℃保存。样品保存期间避免反复冻融
  • 样品运输:样品置于 1.5 ml管中,封口膜封好,干冰运输
  • 数据产出统计及质量评估
  • 对有效reads进行基因覆盖度分析
  • 将有效reads与参考基因组比对,统计reads在基因组不同区域(exon、intron、UTR、intergenic等区域)的分布
  • 预测链特异性转录本
  • 转录本常规注释(Nt、Nr、COG、Swissprot、KEGG、Interpro&GO)及Rfam数据库ncRNA注释
  • 通过RPKM(reads per kilobase of exon per million mapped sequence reads)进行转录本定量和丰度分布统计分析
  • 差异基因表达分析(不少于两个样品):差异基因筛选、聚类分析、基因注释、GO和pathway显著性富集
  • 互补性分析:cis-NAT