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染色质免疫共沉淀测序

染色质免疫共沉淀测序(ChIP-Seq)整合了染色质免疫共沉淀(ChIP)和高通量测序的技术优势,较ChIP-chip具有更大的开放性和精确性,可用于研究任意物种的转录调控蛋白全基因组范围内DNA结合位点,为全面解析基因调控提供了新的支撑技术。ChIP-Seq首先利用抗体特异性地富集蛋白-DNA交联物,然后纯化DNA片段,并经末端修复、加A和加测序接头后,再经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳回收特定大小片段,完成测序文库的制备工作。构建好的文库用Illumina Hiseq 2500进行测序,并通过生物信息学分析,鉴定出目的蛋白与基因组DNA结合的位点。

技术流程| 技术优势| 样品要求| 数据分析|

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  • 精确性高:基因组结合位点定位精确性可达± 50bp。
  • 可靠性高:比ChIP-Chip具有更低的背景,无交叉杂交非特异性。
  • 检测动力学范围广:定量检测不同结合强度转录因子/组蛋白的结合特异性。
  • 全面的分析:可在全基因组范围内鉴定结合位点,无需候选序列信息。
  • 更经济的分析:花费只有全基因组ChIP-Chip的1/30~1/10。
  • 更低的起始样品量:仅需低至10~50ng的免疫沉淀DNA。

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  • 细胞样品:单次样品制备需大于2×107细胞。1%甲醛固定细胞后,PBS清洗细胞3次,离心收集细胞沉淀,液氮速冻,-80℃保存,干冰运输。
  • ChIP DNA样品:样品量大于50 ng,样品浓度不低于10ng/μl,OD260/OD280为1.8~2.0。DNA片段大小在100~500bp之间,主带明显。样品最好进行过ChIP-PCR验证。样品溶于超纯水中,放于DNase-free的不黏管中,管口用封口膜封好,干冰运输。

  • 原始数据产出统计
  • ChIP-Seq序列与参考基因组序列比对
  • ChIP-Seq唯一比对序列在参考基因组上的分布统计,包括在重复序列区、基因区(Promoter,5’UTR,CDS,3’UTR等)和基因间区等区域的分布统计
  • ChIP-Seq唯一比对序列在参考基因组中的覆盖深度统计
  • ChIP-Seq峰检测统计,包括峰数目、峰分布和峰宽度等
  • ChIP-Seq峰定量分析和差异分析测
  • Binding Motif预测
  • ChIP-Seq 峰与下游基因的关联分析
  • 下游基因的Pathway和Gene Ontology显著性富集分析
  • ChIP-Seq数据可视化分析,生成Genome Browser可以导入的文件