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全转录组测序

全转录组测序采用对读测序策略,可以获得更高的测序深度,可全面快速的获取某一条件下组织或细胞绝大部分转录本的定性和定量情况。与表达谱研究相比,全转录组测序除了可对转录本进行更加准确的定量外,还可进行更为复杂的序列分析,如新转录本和罕见转录本发现、 cSNP和 InDel鉴定、可变剪切鉴定、染色体重排鉴定、 lncRNA和UTRs鉴定等,获得更为精确完整的基因表达图谱和突破性的发现。

实验流程| 技术优势| 样品要求| 数据分析|

2011-12-31_140117

1. 样品提取总RNA后,过柱纯化,保留200nt以上的RNA。

   
2. 富集mRNA,并用二价阳离子高温加热的方法将mRNA片断化。

 

3. 以mRNA短片段为模板,用六碱基随机引物反转录合成双链cDNA。


4. 经纯化、末端修复、加碱基A、加测序接头的步骤,根据测序长度和是否做对读测序,确定琼脂糖凝胶电泳回收片段的大小,并进行PCR扩增,完成测序文库的制备。


5. 构建好的文库经cBot扩增,用Illumina Hiseq2500进行对读测序。 

 

  • 精确性高:精确到单核苷酸水平,可区分高度同源的RNA 分子,鉴定剪切变异体和RNA 多态性。
  • 高度开放性:无需预先了解序列信息,可研究任一物种已知和未知的转录本序列及定量信息。
  • 灵敏度高:可检测低丰度转录本。
  • 检测范围广:可在超过6 个数量级范围内实现准确的序列检测和定量分析。
  • 灵活性高:可根据实验目的灵活选择合适的测序reads 深度和reads 读长,以达到对不同丰度转录本及序列变异的检测要求。
  • 高质量的数据:采取长读长对读测序及更高的测序深度,提高了对重复序列和同源序列的辨识能力,有效提高可绘制转录组的比例和转录组装的可信度,获得更多长无误的重叠群contigs。
  • 均匀的覆盖度:采用随机降解转录本和随机反转录的策略制备测序文库,有利于获得更为均匀的读取分布,提高了测序效率。
  • 获取更丰富的转录信息:更高的测序深度和更均匀的覆盖度,帮助研究者发现和区分低丰度的转录本、高度相似的转录本、可变剪切及单个核苷酸多态性。

  • 样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。
  • 样品量:细胞样品请提供至少1×107个细胞,组织样品请提供至少100mg的组织块或切片,RNA样品请提供10 μg以上的总RNA。
  • 样品质量:RNA无明显降解,提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度 ≥ 500 ng/μl,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 8。
  • 样品保存:细胞样品或新鲜组织块(切成~50mg的小块)可用TRIZOL或RNA保护剂处理或液氮冻存后,-80℃保存。RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。
  • 样品运输:样品置于1.5 ml管中,封口膜封好,干冰运输。

1. 无参考基因组的转录组分析(De novo Transcriptome Analysis)

  • 数据产出统计及碱基质量评估;
  • 去除低质量、污染及接头序列;
  • 对序列进行de novo组装,并对组装效果进行统计评估;
  • Unigene长度统计分析及表达丰度分析;
  • 样本间共有、特有及差异Unigene统计;
  • Unigene功能注释:(Nt、Nr、Swissprot、Interpro、GO、KEGG数据库比对)
  • Unigene差异表达及聚类分析(不少于两个样品);
  • 差异Unigene的GO和pathway显著性富集分析。
2. 有参考基因组的转录组分析(Transcriptome analysis with reference genome)
  • 数据产出统计及质量评估
  • Reads与参考基因组序列或转录组序列比对
  • Reads在基因组上的分布统计
  • 反义转录本注释
  • 转录本定量
  • 基因功能注释
  • 基因GO 和pathway显著性富集分析
  • 基因表达差异分析(不少于两个样品)及聚类分析
  • 基因结构及变异分析:可变剪切、基因融合及cSNP鉴定等
  • 预测新基因