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蛋白定性检测

主要用于鉴定单一组分样品或混合样品中的蛋白种类。样品形式可以是从组织或细胞中提取的蛋白混合物,电泳分离后的单一条带,免疫沉淀富集的蛋白等。蛋白样品经胰酶消化后,使用质谱进行鉴定。既可以使用液质联用质谱平台,也可以使用MALDI-TOF/TOF质谱平台。液质联用质谱平台更适合用于复杂的样品,分辨率与准确性更高。

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液质联用的串联质谱法(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS)鉴定蛋白是蛋白质组学研究的首选平台,特异性强,可靠性高。蛋白经胰酶消化形成的肽段先进入液相色谱进行分离,再进行质谱检测。一级质谱检测多肽分子的大小,然后再将肽段打碎,形成一系列离子,即 N端离子系列( B系列)和 C端离子系列( Y系列)。质谱再检测碎片离子的大小,即二级质谱。将质谱数据与蛋白数据库进行比对,获得肽段的序列,特定的多肽序列对应着特定的蛋白,从而鉴定出待检测蛋白。如下图所示:

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★ 采用真正的纳流液相系统,具有更高的灵敏度。

★ 串联质谱,提供序列信息,蛋白鉴定可靠性高。

★ 采用 LC-ESI-MS/MS(Liquid Chromatography Electrospray Ionisation Tandem Mass Spectrometry)配置,具有极高的分辨率,适用于复杂样品的鉴定。

单个蛋白鉴定

1)用于鉴定纯化的单个蛋白的溶液或粉末,或经过 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)的单个条带或二维电泳的单个点。
2)蛋白酶解成多肽。
3)液质联用质谱检测:液相分离多肽,离子化的多肽进入质谱,母离子检测,母离子裂解成一系列子离子,子离子检测。
4)数据库检索。
5)人工验证,输出报告。
全蛋白质组及蛋白混合物的鉴定
用于鉴定含多种蛋白的混合物,包括全蛋白提取物,根据样品的复杂程度采取不同的策略分离后再进行质谱鉴定。对于全蛋白质组,可以先用SDS-PAGE或者液相色谱分离成15~20个组分,酶切消化成肽段,再使用液质联用质谱鉴定。也可将蛋白混合物直接消化成肽段后,用液相色谱分成15~20个组分,再依次使用液质联用质谱仪鉴定。对于IP实验拉下来的蛋白,可以煮沸后用SDS-PAGE分离成5~10个组分,从胶里面回收消化的多肽后,使用液质联用质谱鉴定。