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蛋白修饰检测

使用Thermo Fisher Scientific 公司高分辨液质联用平台Q Exactive与LTQ Orbitrap Velos Pro可对蛋白修饰进行定性检测和定量检测。如果进行定性检测,可以将需要检测的修饰肽段用相应的抗体进行富集后用质谱仪鉴定。如果进行定量检测,可以使用代谢标记(SILAC)或化学标记(TMT和iTRAQ)后,进行质谱定量检测。

实验原理| 实验流程|

蛋白修饰检测的原理是,肽段上某个氨基酸残基被修饰之后,这个肽段的分子量与电荷都可能发生变化。质谱检测时,肽段的一级质谱与二级质谱图m/z峰发生迁移。根据m/z的迁移情况,判断氨基酸残基被修饰的情况,并通过相应的算法推断出被修饰的氨基酸残基的具体位置和修饰的类型。通过迁移峰和原峰的比较,获得修饰的比率,即不同样品间蛋白修饰水平的差异。

定性鉴定

单个蛋白样品可以直接用胰酶消化后,质谱检测蛋白修饰状态。对于混合蛋白样品,需要先通过电泳分离不同分子量大小的蛋白,选取某个区域的蛋白进行酶切消化和质谱检测。也可以是使用特定抗体,将某种蛋白或含有特定修饰的蛋白通过免疫沉淀的方法分离出来,然后直接用胰酶消化后进行质谱检测,或者是免疫沉淀产物通过电泳分离后,从凝胶中回收特定区域的蛋白,进行质谱检测。

定量检测

经代谢标记或化学标记的蛋白,使用电泳或液相色谱进行分离,选取特定的组分进行质谱定量检测。或者是,标记后的蛋白使用特定的抗体进行富集后,质谱定量检测。对于磷酸化蛋白检测,除使用抗体富集外,还可使用二氧化钛等试剂富集磷酸化多肽,然后进行质谱定量检测。